مقاله پژوهشی

جداسازی و شناسایی یک پپتید جدید آنتی­اکسیدانتی از بتاکازئین شیر شتر با پپسین و پانکراتین

 

مسعود همایونی تبریزی¹، احمد آسوده²، هدا شبستریان³

¹استادیار، گروه بیوشیمی بیوفیزیک، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران

² دانشیار، گروه شیمی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران

³ دانشجوی کارشناسی ارشد ، گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران

 

نشانی نویسنده مسوول: مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد، دانشکده علوم پایه، گروه بیوشیمی و بیوفیزیک، مسعود همایونی تبریزی

E-mail: mhomayouni6@gmail.com

 

چکیده

زمینه و هدف: از آنجاکه آنتی­اکسیدانت­های سنتزی، دارای اثرات جانبی است، لذا استخراج آنتی­اکسیدانت­ها از منابع طبیعی فاقد اثرات جانبی مورد نیاز است. هدف از این تحقیق، شناسایی پپتید حاصل از هیدرولیز آنزیمی β-کازئین شیر شتر با پپسین و پانکراتین است.

مواد و روش­ها: هیدرولیز آنزیمی پروتئین β-کازئین شیر شتر با استفاده از آنزیم­های پپسین و پانکراتین انجام­شد. سپس فرکشن­ها بااستفاده از RP-HPLCجداشدند و توالی پپتید با استفاده از اسپکتروفتومتری MALD-TOFشناسایی­شد. فعالیت آنتی‏اکسیدانتی پپتید جداشده با روش­های جذب رادیکال­های DPPH، ABTS، هیدروکسیل و سوپراکسید و مهار اکسیداسیون لینولئیک اسید سنجش­شد.

یافته­ها: نتایج تعیین توالی نشان­داد که پپتید خالص­شده با نام RQ-8 دارای توالی RGLHPVPQ و وزن ملکولی41/903 دالتون است. این پپتید اکسیداسیون لینولئیک اسید را، مهار و به­عنوان جذب­کننده­ی رادیکال 1،1- دیفنیل-2- پیکریل ـ هیدرازیل (DPPH)(IC50 = 0.046 mg/ml) و2،2-آزینو بیس(3-اتیل بنزوتیازولین 6- سلفونیک اسید)(ABTS)(IC50 = 0.085 mg/ ml)، سوپراکسید(O2º−)(IC50= 0.156 mg/ml)، و هیدروکسیل (OHº−) (IC50 = 0.021 mg/ml)  عمل­کرده است. علاوه برآن، سنجش­های فعالیت سلولی نشان­داد که این پپتید RQ-8شناسایی­شده، هیچ سمیّتی بر روی سلول­های سرطانی ریهA549  ندارد.

نتیجه­گیری: این نتایج نشان­داد که پپتید RQ-8جداشده از پروتئین کازئین شیر شتر، دارای فعالیت آنتی­اکسیدانتی است.

 

مقدمه

استرس اکسیداتیو به­علت عدم تعادل بین تولید رادیکال­های آزاد و واکنش­های متابولیسمی ایجادمی­شود. در سلول­ها، ترکیبات اکسیدانت یا گونه­های واکنشی اکسیژن (ROS) باید به­وسیله­ی سازوکارهای حفاظتی حذف ­شوند. سیستم­های دفاعی آنتی­اکسیدانتی، تحت شرایط طبیعی می­توانند گونه­های فعال واکنشی را به­واسطه­ی روش آنزیماتیک (مانند سوپراکسید دیسموتاز سیتوزولی و میتوکندریایی، گلوتاتیون ردوکتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز) و آنتی­اکسیدانت­های غیرآنزیمی (مانند ویتامین­های آنتی­اکسیدانتی A، C و E- کوآنزیم­ها و کوفاکتورها) خنثی­کنند .بنابراین، سیستم دفاعی آندوژن، بدن را در مقابل رادیکال‏های واکنشی حفظ می­کند. در شرایط استرس اکسیداتیو تولید ملکول­های واکنشی با قدرت بالایی مانند: ROS (گونه­های واکنشی اکسیژن)، رادیکال هیدروکسیل ((OH·، رادیکال پروکسیل OOR·))، آنیون سوپر اکسید(O2-·) و RNS (گونه­های واکنشی نیتروژن) مانند پراکسید نیترید (-ONOO) افزایش­می­یابد (1و2). در انسان استرس اکسیداتیو معمولاً در شروع بیماری‏های مزمن نقش بازی می­کند و ازاین­رو، ضرورت­دارد تا آنتی­اکسیدانت­های سنتزی و طبیعی تولیدشوند که بتواند از استرس اکسیداتیو و اثرات زیان­آور آنها جلوگیری­کنند. استفاده از آنتی­اکسیدانت­های سنتزی برای جلوگیری از اثرات زیان­بار رایکال­های آزاد موثرتر است، اما با بروز اثرات جانبی همراه هستند. رویکرد دیگر استفاده از پپتیدهای آنتی­اکسیدانتی با منشاء طبیعی است که اثرات جانبی کمتری ازخود نشان­می­دهند(3).

پپتیدهای فعال زیستی، پپتیدهای مشتق­شده­ی غذایی هستند که فراتر از ارزش غذایی­شان اثرات فیزیولوژیک و شبه­هورمونی در بدن دارند. این گونه پپتیدها در شیر، تخم­مرغ، گوشت و ماهی­ها و همچنین در گیاهان یافته­می­شوند(4). پپتیدهای فعال زیستی در توالی پروتئین والد خود غیرفعال هستند (پپتیدهای فعال زیستی قطعه­های پروتئینی خاص غیرفعال با توالی پروتئین پیش­ساز هستند) و می­توانند به­وسیله­ی هیدرولیز آنزیمی درطی هضم معدی روده­ای یا درطی پردازش غذایی آزادشوند (همانند کامل­شدن پنیر و تخمیر شیر). پپتیدهای فعال­زیستی معمولا دارای 2 تا 20 اسید آمینه می­باشند(5). به­دنبال هضم، پپتیدهای فعال­زیستی می‏توانند ازطریق روده، وارد گردش خون شوند و اثر سیستماتیک خود را اعمال­کنند، یا اثری موضعی در مجرای معدی روده­ای ایجادکنند. خصوصیت ساختاری و ترکیب آمینواسید و توالی این پپتیدها، ممکن­است نقش­های متنوعی را، شامل: شبه-افیونی، اتصال مواد معدنی، تعدیل ایمنی، ضد میکروبی، آنتی­اکسیدانت، ضد انعقادی، کاهش­دهنده­ی کلسترول و کاهش­دهنده­ی فشار خون بازی­کنند. بسیاری از پپتیدهای فعال­زیستی شناخته­شده، چند عملکردی هستند و می­توانند بیش ازیک اثر  زیستی داشته و حتی به­عنوان ترکیبات غذاهای فعال یا مواد مغذّی مورداستفاده قرارگیرند. به­هرحال، پروتئین­های شیر شتر، می­توانند به­عنوان منبع اصلی برخی از پپتیدهای فعال­زیستی عمل­کنند که تاکنون تحقیقی دراین زمینه انجام­نشده­است. هدف از این تحقیق، شناسایی پپتیدآنتی­اکسیدانتی حاصل از هیدرولیز آنزیمی β-کازئین شیر شتر با پپسین و پانکراتین است(9 و 8،7،6).

 

مواد و روش­ها

مواد مورد استفاده دراین پژوهش، شامل آنزیم پپسین و پانکراتین، ترکیب (DPPH) 2,2^-Dipheny-l-picrylhydrazyl، فنانترولین، گلوتاتیون احیاءشده، محلولABTS2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)، Butylated hydroxyanisole(BHA)، کلریدآهن FeCl₂ و نیز تری­کلرواستیکاسید، اتانول،EDTA و استونیتریلاز بوده که به­ترتیب از شرکت­های سیگما ـ آلدریش آمریکا و مرک آلمان خریداری­ شدند.

تهیه­ی هیدرولیزات: برای این منظور، در پروتئین β-کازئین شیر شتر با استفاده از آنزیم­های پپسین و پانکراتین، هضم انجام­شد(10). عصاره­ی پروتئین β-کازئین شیر شتردر بافر سدیم فسفات و در pH بهینه‏ی آنزیم 5 بار رقیق­سازی­شد. سپس به پروتئین رقیق­شده به­نسبت 20/1 (آنزیم به سوبسترا، وزنی/ وزنی) آنزیم پپسین در pH اپتیمم 5/2 اضافه­شد. دراین لحظه، هیدرولیز پروتئین توسط پپسین شروع­شد و به­مدت 120 دقیقه در انکوباتور در دمایCº 37 درجه سانتی­گراد قرارگرفت تا پروتئین به هیدرولیزات خود تبدیل­شود. سپس به مخلوط واکنش برای هضم بیشتر آنزیم پانکراتین به­نسبت 20/1( وزنی/ وزنی آنزیم به سوبسترا) اضافه­شد ولی قبل از اضافه­کردن این آنزیم، pH مخلوط به 5/7 رسانده­شد.

پس ازاتمام زمان هیدرولیز، محلول برای 15 دقیقه در آب جوش قرارگرفت تا فعالیت آنزیم متوقف­شود. سپس سوسپانسیون حاصل در 8000 دور در دقیقه  (rpm)برای 15 دقیقه سانتریفوژ شد. محلول رویی به­عنوان هیدرولیزات جداسازی­شد. سپس با کمک دستگاه اولترافیلتراسیون و با غشائ 3000 دالتون، پپتیدهای کوچکتر از این محدوده تهیه­شد. فرایند جداسازی پپتیدها طی چند مرحله صورت­گرفت. در هر مرحله، برای انجام فرایند کروماتوگرافی بر روی هیدرولیزات، از ستون C-18 مخصوص جداسازی نیمه کمی استفاده­شد. برای این منظور، دو حلال آب و استونیتریل که حاوی1/0% تری فلوئورو استیک اسید در هر حلال بودند، موزد استفاده قرارگرفت. همچنین نمونه هر بار با غلظت 30 میلی­گرم بر میلی­لیتر در آب، تهیه و به دستگاه تزریق شد. فرایند تفکیک پپتیدها در شیب غلظت متغیری از دو حلال نسبت به زمان صورت­گرفت. به­گونه­ای که درصد ترکیب دو حلال در زمان شروع فرایند تا دقیقه­ی پنجم، شامل %95 آب و %5 استونیتریل بود. این ترکیب طی مدت 40 دقیقه به %60 آب  %40 استونیتریل رسید و سپس طی مدت 15 دقیقه مجدداً به وضعیت اول؛ یعنی %95 آب و %5 استونیتریل بازگشت. طی این مدت سرعت جریان حلال مورد استفاده، برابر با 2 میلی لیتر بر دقیقه بود. فراکشن­های مختلف پس از جمع­آوری با فریز درایر خشک شدند.

بررسی قابلیت حذف رادیکال:DPPH این آزمایش با کمی تغییرات در روش وو و همکاران صورت­گرفت(11). 5/0 میلی لیتر محلول DPPH 1/0 میلی مولار تهیه­شده در اتانول %95 با 100 میکرولیتر محلول پپتید یا استاندارد مخلوط­شد. محلول حاصل­شده به­مدت 30 دقیقه در تاریکی و دمای 37 درجه­ی سانتی­گراد قرارگرفت. سپس جذب نمونه­ها درطول موج 517 نانومتر خوانده­شد. به­منظور مقایسه­ی فعالیت پپتید از ترکیب استاندارد، گلوتاتیون احیاء(GSH) به­عنوان یک آنتی­اکسیدان استاندارد استفاده­شد. برای تعیین مقدار IC₅₀(IC₅₀ غلظت مورد نیاز برای مهار 50 درصد فعالیت آنتی­اکسیدانتی تعریف­می­شود). برای پپتید و ترکیب استاندارد، آزمایش در هشت غلظت مختلف از محلول پپتید و استاندارد صورت­گرفت. هر آزمایش در سه نوبت، انجام شد و مقادیر میانگین ملاک محاسبات قرارگرفت. درصد فعالیت رادیکال زدایی ازطریق رابطه­ی ذیل محاسبه ­شد:

در این رابطه، جذب بلانک، نشان­دهنده­ی جذب محلول شاهد است که محتوای 5/0 میلی­لیتر محلول DPPH 1/0 میلی مولار و100 میکرولیتر اتانول %95 به­جای محلول پپتید است و جذب واکنش، نشان­دهنده­ی جذب محلول محتوای نمونه­ی پپتید است.

بررسی قابلیت حذف رادیکال ABTS: این روش هم برای ترکیبات هیدروفیل و هم برای ترکیبات لیپوفیل قابل­استفاده است. برای انجام این آزمایش، از روش ری و همکاران استفاده­شد(12). به­منظور تهیه­ی محلول رادیکال ABTS،2میلی­لیتر ABTS 7 میلی مولار  و 1 میلی­لیتر پتاسیم پرسولفات 45/2 میلی مولار با یکدیگر مخلوط­گردید و به­مدت 16 ساعت در تاریکی و دمای 25 درجه سانتی­گراد قرارداده­شد. محلول حاصل با افزودن آب، تا رسیدن به جذب 756/0 درطول موج 743 نانومتر رقیق شد. غلظت محلول رقیق­شده حدود 514/0 میلی مولار بود. سپس1 میلی لیتر از محلول رقیق­شده­ی رادیکال ABTS با 100 میکرولیتر محلول پپتید مخلوط­شد و جذب محلول واکنش تا حدود دقیقه­ی هفتم؛ یعنی تا زمانی که فعالیت نمونه به­مقدار بیشینه­ی خود برسد، پیگیری­شد. این آزمایش برای به­دست­آوردن IC₅₀ در هشت غلظت مختلف از پپتید و ترکیب استاندارد صورت­گرفت. ترکیب استفاده­شده­ی استاندارد در اینجا، ترکیب گلوتاتیون بود. محلول شاهد محتوای 100 میکرولیتر آب مقطر به جای محلول پپتید یا استاندارد بود. این آزمایش در سه نوبت انجام­شد و مقادیر میانگین، ملاک محاسبات قرارگرفت. درصد فعالیت حذف رادیکال از رابطه­ی ذیل به­دست­آمد:

در این رابطه بلانک نماینده­ی جذب محلول شاهد و جذب واکنش نشان­دهنده­ی جذب محلول نمونه است.

اندازه‏گیری و محاسبه‏ی اثرگذاری پپتید در حذف رادیکال‏های هیدروکسیل OH^.: دراین آزمایش، رادیکال‏های هیدروکسیل در سیستم فنانترولین/ EDTA/H₂O₂، تولید و حذف آن توسط پپتید اندازه‏گیری­شد. روش کار به­صورت ذیل انجام شد :

e ²⁺ + H₂O₂→ Fe ³⁺ + OH^.+ OH^-

فعالیت حذف رادیکال‏های هیدروکسیل با استفاده از روش Lijun و همکاران صورت­گرفت(11). به­این ترتیب­که در ابتدا، مخلوطی از 600 میکرولیتر فنانترولین با غلظت 5 میلی‏مولار، 600 میکرولیتر سولفات آهن با غلظت 5 میلی‏مولار، 600 میکرولیتر EDTA با غلظت 15 میلی‏مولار و 400 میکرولیتر بافر سدیم فسفات با غلظت 2/0 مولار و4/7pH=‌ آماده­شد، سپس 600 میکرولیتر از نمونه‏ی پپتیدی با غلظت 1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر به محلول و درنهایت 800 میکرولیتر آب اکسیژنه اضافه­شد. مخلوط ساخته­شده به­مدت 1 ساعت در دمای^°C37 ، انکوبه و جذب آن توسط دستگاه طیف­سنجی UV درناحیه‏ی 536 نانومتر اندازه‏گیری­شد. نتایج حاصل از فعالیت پپتید، توسط فرمول ذیل محاسبه­شد(13):

= (A_S – A₀) × 100/ (A_C –A₀)درصد فعالیت حذف رادیکال‏های هیدروکسیل

در رابطه‏ی بالا A_S جذب نمونه، A₀جذب محلول شاهد(محلول حاوی آب به­جای نمونه) و A_Cجذب محلول کنترل در غیاب H₂O₂ است.

سنجش فعالیت جذب رادیکال سوپر اکسیدبا استفاده از روش پونال انجام­شد(14). 80 میکرولیتر از پپتید یا آسکوربیک اسید به عنوان استاندارد با 80 میکرولیتر بافر تریس50 میلی مولار 3/8 pH=به داخل پلیت 96 چاهک ریخته­شد.40 میکرولیتر از محلول پیروگالول در HCl 10 میلی مولار به هر چاهک اضافه­­گردید. جذب پس از 4 دقیقه درطول موج 420 نانومتر خوانده­شد. فعالیت آنتی­اکسیدانت در حضور و غیاب پیروگالول و پپتید از رابطه­ی ذیل محاسبه­شد:.

سنجش فعالیت مهار اکسیداسیون لینولئیک اسید: فعالیت مهار اکسیداسیون اسید چرب لینولئیک اسید پپتیدRQ-8، اندازه­گیری­شد(15). به­طورخلاصه، پپتید در 5/2 میلی­لیتر بافر فسفات50 میلی مولار7pH=حل شد و 5/2 میلی­لیتر اتانل5/99 درصدو 5/32 میکرولیتر لینولئیک اسید به آن اضافه­شد و حجم نهایی با استفاده از آب مقطر به 25/6 میلی­لیتر رسید. محلول در یک لوله­ی در پیچ­دار، ریخته و به­مدت 7 روز نگهداری با دمای 60 درجه سانتی­گراد در انکوباتور قرارداده­شد. سپس در زمان‏های مختلف مقدار 50 میکرولیتر از محلول انتخاب­شد و 35/2 میلی‏لیتر از اتانول 75%، 50 میکرولیترآمونیوم تیوسیانات 30% و 50 میکرولیتر دی کلرید آهن با غلظت20 میلی‏مولار حل­شده در اسیدکلریک 5/3%، به آن اضافه­­گردید. پس از 5 دقیقه جذب محلول در طول موج 500 نانومتر ثبت­شد. هرچه پپتید فعالیت بهتری داشته­باشد، افزایش جذب کمتر، پیش­خواهدآمد. دراین آزمایش، از گلوتاتیون به­جای پپتید، به­عنوان پپتید استاندارد و از بافر سدیم فسفات، به­عنوان استاندارد منفی استفاده ­شد.

سنجش سمیّت: سنجش سمیّت با استفاده از روش موسمان انجام­شد(16).سلول­هایA549 مورد استفاده دراین پژوهش از بانک سلولی انسیتو پاستور تهران خریداری­شد. این سلول­ها در محیط کشت RPMI حاوی پنیسیلین و استرپتومایسین و سرم جنین گاوی 10 درصد و در انکوباتور حاوی 5 درصد CO₂ و95 درصد رطوبت و دمای 37 درجه سانتی­­گراد نگهداری­شد. سلول­ها به میزان 1×10⁵ cells/ml در میکرو پلیت 96 خانه ریخته­شد. سپس سلول­ها با غلظت­های متفاوت پپتید صفر تا یک میلی­گرم بر میلی­لیتر به­مدت 48،24 و72 ساعت انکوبه­شد. محلول بافر فسفات به­عنوان کنترل استفاده­گردید. بعد از انکوباسیون محیط کشت دور ریخته­شد و مقدار 20 میکرولیتر از محلول3 - ( 4و 5 - دی متیل تیازول 2- ایل) 2و 5- دی فنیل تیازولیوم برمیدMTT به هر چاهک، اضافه و پلیت برای 4 ساعت در انکوباتور قرارداده شد.پس از گذشت این زمان، محیط کشت وMTT از چاهک، خارج و بلورهای فورمازان تشکیل­شده در سلول‏های زنده در 150 میکرولیتر محلول دی متیل سولفواکساید(DMSO) حل­شد و محلول بنفش رنگی با درجات رنگ متفاوت آماده­گردید. شدت رنگ این محلول­ها که معیاری از تعداد سلول­های زنده در محیط است، در طول موج 570 نانومتر با استفاده از دستگاه ELISA plate reader سنجش­شد و میزان حیات سلولی با استفاده از معادله­ی ذیل محاسبه­گردید:

100×_جذب.کنترل/(_جذب.نمونه-1)=درصد سمیت

_جذب.نمونه=جذب نمونه تیمار شده در 570 نانومتر

_جذب.کنترل =جذب نمونه سلول بدون تیمار در 570 نانومتر

سنجش فعالیت همولیز: فعالیت همولیز پپتید RQ-8 با استفاده از سلول­های قرمز خونی تازه­ی فردی از انسان با گروه خونی(O⁺)  مطالعه ­شد.5میلی­لیتر از خون در50 میکرولیتر EDTA در دور rpm 4500 به­مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی (پلاسما)، دور ریخته­ و سلول­های قرمز خون با بافر فسفات 3 بار شسته­شد و در rpm4500 سانتریفیوژگردید تا اریتروسیت­ها به­طور کامل از پلاسما جدا شود. سپس فعالیت همولتیک با روش اسپکتروفتومتری انجام­شد. سرانجام 20 میلی­لیتر بافر فسفات به سلول­های قرمز خون اضافه­شد. درانتها، 10 میکرولیتر از پپتید RQ-8 در غلظت­های12.5، 50،25، 100و 200 میکروگرم بر میلی­لیتر به 190 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی اضافه­شد. مخلوط برای 30 دقیقه در دمای 30 درجه سانتی­گراد نگهداری­شد. سپس نمونه­ها در دور rpm 4000 برای 5 دقیقه سانتریفیوژشد. 100 میکرو لیتر از محلول رویی با یک میلی­لیتر از بافر فسفات رقیق­گردید و هموگلوبین در محلول رویی در 560 نانومتر با اسپکتروفتومتری اندازه­گیری­شد. بافر فسفات به­عنوان کنترل منفی استفاده­شد(17).

روش تجزیه و تحلیل آماری داده­ها: درصد زنده­ماندن سلول­ها، با استفاده از نرم­افزار اکسل محاسبه­گردید. همچنین انحراف معیار و انحراف از میانگین داده­ها و روش تجزیه و تحلیل آماری داده­ها به­وسیله­ی نرم­افزارSPSS محاسبه­شد. به­منظور مقایسه­ی بقاع سلول­های تیمار شده با پپتید و بررسی وجود اختلاف معنادار در نتایج حاصل ­شده، از نرم­افزار SPSSو آزمون آنالیز واریانس یک­طرفه(one-way ANOVA) و تست Tukey استفاده­ شد.

 

یافته­ها

در این پژوهش، پروتئین­های شیر شتر با استفاده از دو آنزیم پپسینو پانکراتین هیدرولیز شد. هیدرولیزات­ها با استفاده از روش‏های اولترافیلتراسیونو RP-HPLC جداسازی ­شدند. یک فراکشن با بیشترین مقدار سطح پیک در کروماتوگرام RP-HPLC دیده ­شد (شکل.1). به­منظور دست­یابی به خلوص بیشتر، نمونه­ی جمع­شده از پیک اصلی، مجدداً با روش RP-HPLC با همان شرایط خالص­ سازی ­شدند. پپتید خالص با دستگاه اسپکتروفتومتری MALDI-TOF/TOF تعیین توالی شد. آنالیز نتایج طیف­سنجی جرمی توالی، پپتید RGLHPVPQ (که وزن ملکولی آن41/903 دالتون می­باشد) را برای پپتید جداشده نشان­داد. این پپتید به­اختصار RQ-8 نام­گذاری­شد (شکل.2).

 

شکل1: کروماتوگرام های RP-HPLC هیدرولیزات پروتئین کازوئین شیر شتر با آنزیم های پپسین و پانکراتین. پیک اصلی خارج شده در دقیقه27 (مشخص شده با ستاره) جمع آوری و پس از خالص سازی مجدد، توالی پپتید آن با کمک طیف سنجی جرمی تعیین شد.   شکل 2: طیف اسپکتروفتومتری جرمی پپتید خالص شده. ( a) جرم قطعاتایجاد شده از پپتید اولیهRQ-8 ، (b) تفسیر نتایج جرمی و تعیین توالی پپتید ِRQ-8..

توالی پپتید مورد نظر به­وسیله­ی موسسه­ی "GL Biochem" واقع در شهر شانگهای چین سنتزشد. خصوصیات آنتی­اکسیدانتی پپتید جداشده از هیدرولیز پروتئین β-کازوئین ارزیابی­شد. دراین مطالعه، فعالیّت جذب رادیکال­های DPPH،ABTS هیدروکسیل و سوپراکسید بررسی­گردید(شکل 3.الف). فعالیت جذب رادیکال DPPHپپتید RQ-8را در مقایسه با گلوتاتیون به­عنوان استاندارد نشان می­دهد. فعالیت جذب رادیکال DPPH پپتید با زیادشدن غلظت افزایش­می­یابد. فعالیت جذب رادیکال­های ABTS و هیدروکسیل و سوپر اکسید اندازه­گیری­شد و مشابه با آزمایش DPPH با افزایش غلظت پپتید میزان حذف رادیکال­های مزبور افزایش­یافت (شکل­های 3.ب، پ، ت). میزانIC₅₀(برحسب میلی­گرم بر میلی­لیتر) فعالیت آنتی­اکسیدانی پپتید در تست­هایDPPH برابر با 046/0، ABTS برابر با 085/0، هیدروکسیل برابر با 021/0 و سوپراکسید برابر با 0156/0 به­دست­آمد.

(شکل 4) مهار اکسیداسیون اسید لینولئیک را نشان­می­دهد. پپتید RQ-8 ازتشکیل محصول اکسیداسیون لیپیدی جلوگیری­کرده است. دوره­ی مهار اکسیداسیون لیپید با آنتی­اکسیدانتBHA مقایسه­شد. میزان فعالیت مهاریBHA بیشتر از پپتید مشاهده­شد.

 

شکل3: فعالیت جذب رادیکالهای (الف) DPPH، (ب) هیدروکسیل، (پ) سوپراکسید، (ت) ABTS.گلوتاتیون (GSH) و اسید آسکوربیک به عنوان کنترل مثبت استفاده شدند.

تاثیر سمیّت پپتیدRQ-8 بر روی سلول­های A549 و فعالیت همولیز: تاثیر سمیّت پپتید خالص­شده بر روی سلول­های A549 انجام­شد. شکل.5.الف، نشان­می­دهد که در غلظت 1 میلی­گرم بر میلی­لیتر، تنها 20 درصد از حیات سلولی کم­شده­است. در غلطت حداقل آزمایش­شده (3.7 میکروگرم بر میلی­لیتر)90 درصد سلول­های سرطانی حیات خود را حفظ ­کردند. حفظ حیات سلولی در مقابل غلظت­های مختلف پپتیدی، می­تواند به علت این باشد که این پپتید از یک منبع طبیعی غذایی مانند شیر مشتق شده­است(شکل.5.ب). فعالیت همولیز، پپتید RQ-8 را بر روی اریتروسیت­های خون نشان­می­دهد. نتایج نشان­داد که پپتید RQ-8 اثر همولتیک بر روی سلول­های قرمز خون ندارد.

 

بحث

به­­طورکل، پپتیدهای آنتی­اکسیدانت قادر به عمل به­عنوان جاذب رادیکالی، دهنده­ی پروتون و شلاته­کننده­ی یون هستند. توالی پپتیدهای زیستی، فاکتور تعیین­کننده در فعالیت آنتی­اکسیدانت­هاست. حضور ریشه­های اسید آمینه­ای مشخص، به­مخصوص هیستیدین، تیروزین، تریپتوفان، میتونین، سیستئین و پرولین، به­طور معناداری با فعالیت خاموش­کنندگی پپتیدها همبستگی  دارند(18و19).

 

شکل4: سنجش مهار اکسیداسیون اسید لینولئیک پپتید RQ-8، BHA به عنوان کنترل مثبت و بافر به عنوان کنترل منفی استفاده شد.     شکل5:(الف) تاثیر پپتید RQ-8 بر قابلیت زیستی سلولهای A549..(ب) فعالیت همولیز پپتید RQ-8 در مقابل اریتروسیت-‏ های انسانی سنجش شد. سنجش برای همه آزمایشات بصورت 3 بار تکرار انجام شد.

پراکسیداسیون لیپید یک مورد اصلی در پیدایش کیفیت تغییر و زوال و بدترشدن فرایند مزه و طعم غذاهاست. پراکسیداسیون همچنین در ارزش مغذی غذاها و در پیدایش تعدادی از بیماری­ها موثر است. در توالی پپتید RQ-8 دو اسید آمینه­ی غیرقطبی شامل لوسین و گلایسین وجود دارد که در خصوصیت آنتی­اکسیدانتی پپتید سهیم هستند. با استفاده از اسیدهای چرب غیراشباع دارای چند پیوند دوگانه، مهار پراکسیداسیون درحضور ترکیبات آنتی­اکسیدانت آزمایش­شد. پپتید RQ-8 توانایی حفاظت از پراکسیداسیون لینولئیک اسید را در یک دوره­ی 7 روزه داشت. دارابودن هیدروفوبیسیته بالا برای آنتی­اکسیدانت­ها و برای دسترسی به اهداف هیدروفوبیک بسیارمهم است. احتمالاً حضور اسیدهای آمینه­ی هیدروفوب در توالی پپتید خالص­شده، ممکن­است در مهار پراکسیداسیون لیپید با افزایش حلالیّت پپتیدها در لیپید و بنابراین برهم­کنش آسان­تر با گونه­های رادیکال آزاد سهیم باشد. باقی­مانده‏های آمینواسیدی شامل هیستیدین، پرولین، والین، گلایسین و لوسین که در داخل توالی پپتید وجود دارند، احتمالاً در فعالیت جذب رادیکال سهیم هستند. اسیدهای آمینه­ی آروماتیک، می­توانند اهداکننده­ی پروتون یا الکترون به رادیکال­های مراکز دچار کمبود الکترون موثر باشند. ازاین­رو، در فعالیت جذب رادیکال موثر هستند(20و21). ترکیبات اسید آمینه هیدرولیزات، مستقیماً با فعالیت‏های زیستی آنها در ارتباط است. هیستیدین یا پپتیدهای حاوی هیستیدین، دارای توانایی به دام­انداختن رادیکال لیپید به­دلیل حلقه­ی ایمیدازول می­باشند. اسیدهای آمینه­ی آروماتیک مانند تریپتوفان فعالیت آنتی­اکسیدانتی بروزمی­دهند. زیرا    می­توانند به آسانی به رادیکال­های فاقد الکترون پروتون اهدانمایند. چندین اسیدآمینه مانند لوسین، آرژنین، پرولین، والین و هیستیدین به­طور کلی به­صورت آنتی­اکسیدانت لحاظ می­شوند. همانطور که گفته­شد، پپتید استخراج­شده در تحقیق ما، حاوی اسید آمینه­های فوق می‏باشد که نشان ­می­دهد ممکن­است فعالیت بالقوه­ی آنتی­اکسیدانتی داشته­باشد. تاکنون، مطالعات فراوانی بر روی نقش آنتی‏اکسیدانی منابع گیاهی و جانوری انجام­شده­است. در مطالعه­ای، اثرات حفاظتی پپتید خالص­شده از هضم گوارشی صدف خوارکی صورت­گرفت. دراین تحقیق، هضم گوارشی در شرایط vitroin به ­کار گرفته ­شد و یک پپتید آنتی­اکسیدانتی قوی از هیدرولیز پروتئین­های صدف خوراکی به­دست­آمد. این هیدرولیزات از خلال غشاء اولترافیلتراسیون 3 کیلودالتون عبورداده­شد و سپس توسط RP-HPLC خالص­سازی­گردید. توالی پپتید  EKQELKQELEDLLبا وزن ملکولی 60/1 کیلو دالتون به­دست آمد. فعالیت بالای مهار پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع دارای چند پیوند دوگانه بیشتر از آنتی­اکسیدانت طبیعی آلفا توکفرول نشان­داد. سنجش جذب رادیکال هیدروکسیل و سوپراکسید انجام­شد و مقدار IC₅₀ 76/28 و 97/78 میکرومولار به ترتیب به­دست ­آمد. علاوه بر آن سنجش MTT هیچ سمیّتی بر روی سلول­های فیبروبلاست جنینی ریه­ی انسانی (MRC-5) نداشت. این نتایج نشان­داد که این پپتید فعالیت قوی آنتی­اکسیدانتی دارد (22).

در مطالعه­ی دیگری، بررسی خصوصیات آنتی­اکسیدانتی و ضدالتهابی پپتید lunasin برای جلوگیری سلول­های سرطانی ماکروفاژهای RAW 264.7 صورت­گرفت. استرس اکسیداتیو و التهاب دو فاکتور حیاتی نشان­داده­شده در سرطان و بیماری­های نابودکننده است. دراین مطالعه، نشان داده شده که این پپتید چطور اثر ضد سرطان دارد. پپتید lunasin شامل 43 اسید آمینه­ی ­دانه­ای سویای جدا شده­است. این پپتید اکسیداسیون لینولئیک را، مهار و به­عنوان جذب رادیکال ABTS عمل­کرد. این پپتید همچنین آزادکردن سیتوکین­های پیش­برنده­ی التهاب TNF-α و IL-6 را مهارمی­کند. درنتیجه، پپتیدهای دارای فعالیت بالای آنتی اکسیدانتی و ضد اتهاب می­توانند از سرطان جلوگیری­کنند (23).

مطالعه­ی جداسازی و شناسایی پپتیدهای آنتی­اکسیدانتی حاصل از هیدرولیز پروتئین کلاژن خوک توسط لی و همکاران صورت گرفت. در این مطالعه، کلاژن پوست خوک به­وسیله­ی پروتئازهای متفاوت هیدرولیز شد و پپتید های آنتی­اکسیدانتی به­دست­آمد. چهار پپتید دارای فعالیت بالای آنتی­اکسیدانتی که رادیکال DPPH را، جذب و به­عنوان شلاته­کننده­ی فلزات، عمل­ و پراکسیداسیون لینولئیک اسید را مهارمی­کند، وجوددارد. این چهار پپتید توسط سیستم کروماتوگرافی متوالی ابتدا ژل فیلتراسیون، تعویض یونی و HPLC جداشدند. وزن ملکولی و توالی پپتیدهای جداشده توسط دستگاه اسپکترومتری جرمی محاسبه ­شد. یک پپتیدی دارای فعالیت بالای آنتی­اکسیدانتی با توالی RQGA سنتز شد (24).

مطالعه­ی فعالیت آنتی­اکسیدانی vitroinو vivoin پپتیدهای جداشده از هیدرولیزات پروتئین­های عضله­ی وزغ، نشان­داد که پپتید خالص­شده دارای توالیCGRHKTF  و وزن ملکولی 6/861 دالتون است. این پپتید به­عنوان جذب­کننده­ی رادیکال DPPH، هیدروکسیل و پراکسیداسیون لیپید و آسیب به DNA را مهارمی­کند. این پپتید فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی شامل کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز  در رَت را افزایش داد(25).

پروتئین­های جداشده­ی آب پنیر توسط آلکالاز برای زمان­های 5/0، تا 8 ساعت هیدرولیزشد و مشخص­گردید که نمونه­ی هیدرولیزاتِ ساعت پنجم، فعالیت قوی­تری دارد. نمونه­ی هیدرولیزات ساعت پنجم، توسط ستون سفادکس جی-10 ژل کروماتوگرافی جداسازی­شد و چهار فرکشن به­دست­آمد که متشکل از پپتیدهایی با وزن مولکولی بزرگتر از 40 کیلودالتون، 8/2 تا 40 کیلودالتون، 1/0 تا 8/2 کیلودالتون و کوچکتر از 1/0 کیلودالتون بود که فرکشن سوم فعالیت آنتی­اکسیدانی قوی­تری را نشان داد. درصد فعالیت حذف رادیکال DPPH برای نمونه­های ساعت پنجم هیدرولیز و فرکشن های یک تا چهار و همچنین آنتی اکسیدان استاندارد آسکوربات به­ترتیب برابر با %33/21، %33/25، %13/47 و %67/58، %73/14 و %33/96 بود. همچنین مقادیر فعالیت حذف رادیکال هیدروکسیل برای نمونه­های مذکور، به­ترتیب برابر با %33/23، %00/35، %33/47 و %67/65، %33/23 و %33/75 بود(26). در تحقیق، پپتید  RQ-8 جداشده از کازئین شیر شتر نشان داد که دارای فعایت آنتی­اکسیدانتی مشابه با پپتیدهای جداشده از منابع مختلف است.

توسعه­ی ترکیبات آنتی­اکسیدانتی از منابع طبیعی در علوم زیستی و غذایی مهم است. دراین تحقیق، یک پپتید آنتی­اکسیدانتی از پروتئینβ-کازوئین شیر شتر با هضم آنزیم­های پپسین و پانکراتین شناسایی­کردیم. پپتید آنتی­اکسیدانتی RQ-8 با قدرت بالای جذب رادیکال­های آزاد، توانست اکسیداسیون لیپیدها را نیز مهارکند. با این نتایج، پیشنهادمی­شود که این پپتید ممکن است نویددهنده­ی آنتی­اکسیدانت برای مکمل­های غذایی باشد. هرچند مطالعات بیشتر در سیستم invivo ضروری است.

 

تشکر و قدر دانی

این مقاله، حاصل طرح تحت عنوان " استخراج و خالص­سازی پپتیدهای فعال زیستی از شیرشتر با استفاده از آنزیم­های پروتئاز و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آنها" ست که درسال 1392به تصویب­رسیده و با حمایت دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد اجراشده­است. بدین­وسیله نویسندگان مقاله از معاون محترم پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی مشهد که در جهت فراهم­آوردن امکانات این مطالعه همکاری لازم را مبذول داشتند، کمال تشکر و قدردانی را دارند.

 

References

1. Zhong S, Ma C, Lin YC, Luo Y. Antioxidant properties of peptide fractions from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) processing by-product protein hydrolysates evaluated by electron spin resonance spectrometry. Food Chem. 2011;126(4):1636-42.
2. Stadtman ER. Protein oxidation and aging. Free Radic Res. 2006;40(12):1250-8.
3. Li Y-W, Li B. Characterization of structure–antioxidant activity relationship of peptides in free radical systems using QSAR models: Key sequence positions and their amino acid properties. J Theor Biol. 2013;318:29-43.
4. Taheri A, Sabeena Farvin KH, Jacobsen C, Baron CP. Antioxidant activities and functional properties of protein and peptide fractions isolated from salted herring brine. Food Chem. 2014;142:318-26.
5. De Gobba C, Espejo-Carpio FJ, Skibsted LH, Otte J. Antioxidant peptides from goat milk protein fractions hydrolysed by two commercial proteases.Int Dairy J.2013l; 96(7):4242-51.
6. Li Z, Jiang A, Yue T, Wang J, Wang Y, Su J. Purification and identification of five novel antioxidant peptides from goat milk casein hydrolysates. J dairy Sci. 2013;96(7):4242-51.
7. Hernández-Ledesma B, Quirós A, Amigo L, Recio I. Identification of bioactive peptides after digestion of human milk and infant formula with pepsin and pancreatin. Int Dairy J. 2007;17(1):42-9.
8. Puchalska P, Marina ML, Garcia MC. Isolation and identification of antioxidant peptides from commercial soybean-based infant formulas. Food Chem. 2014;148:147-54.
9. Peng X, Xiong YL, Kong B. Antioxidant activity of peptide fractions from whey protein hydrolysates as measured by electron spin resonance. Food Chem. 2009;113(1):196-201.
10. Hernandez-Ledesma B, Amigo L, Recio I, Bartolome B. ACE-inhibitory and radical-scavenging activity of peptides derived from beta-lactoglobulin f(19-25). Interactions with ascorbic acid. J Agric Food Chem. 2007;55(9):3392-7.
11. Hernandez-Ledesma B, Davalos A, Bartolome B, Amigo L. Preparation of antioxidant enzymatic hydrolysates from alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin. Identification of active peptides by HPLC-MS/MS. J Agric Food Chem. 2005;53(3):588-93.
12. Castro MM, Fandiño RLA, Sanchez MIR, Gonzalez MMR, De Artiñano AA. Bioactive peptides derived from the proteins of egg white by means of enzymatic hydrolysis. 2012;Patent US8227207 B2.
13. Saiga A, Tanabe S, Nishimura T. Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment. J Agric Food Chem. 2003;51(12):3661-7.
14. Liu Q, Kong B, Xiong YL, Xia X. Antioxidant activity and functional properties of porcine plasma protein hydrolysate as influenced by the degree of hydrolysis. Food Chem. 2010;118(2):403-10.
15. Sila A, Sayari N, Balti R, Martinez-Alvarez O, Nedjar-Arroume N, Moncef N, et al. Biochemical and antioxidant properties of peptidic fraction of carotenoproteins generated from shrimp by-products by enzymatic hydrolysis. Food Chem. 2014;148:445-52.
16. Byun H-G, Lee JK, Park HG, Jeon J-K, Kim S-K. Antioxidant peptides isolated from the marine rotifer, Brachionus rotundiformis. Process Biochem. 2009;44(8):842-6.
17. Rival SG, Boeriu CG, Wichers HJ. Caseins and casein hydrolysates. 2. Antioxidative properties and relevance to lipoxygenase inhibition. J Agric Food Chem. 2001;49(1):295-302.
18. Yousef MI. Aluminium-induced changes in hemato-biochemical parameters, lipid peroxidation and enzyme activities of male rabbits: protective role of ascorbic acid. Toxicology. 2004;199(1):47-57.
19. Salami M, Yousefi R, Ehsani MR, Razavi SH, Chobert J-M, Haertlé T, et al. Enzymatic digestion and antioxidant activity of the native and molten globule states of camel α-lactalbumin: Possible significance for use in infant formula. Int Dairy J. 2009;19(9):518-23.
20. Quiros A, del Mar Contreras M, Ramos M, Amigo L, Recio I. Stability to gastrointestinal enzymes and structure-activity relationship of beta-casein-peptides with antihypertensive properties. Peptides. 2009;30(10):1848-53.
21. Haenen HEMG, Bleijlevens E, Elzerman H, Temmink JHM, Koeman JH, Van Bladeren PJ. Cytotoxicity of 2-tert-butyl hydroquinone glutathione conjugates after apical and basolateral exposure of rat renal proximal tubular cell monolayers. Toxicol in Vitro. 1996;10(2):141-8.
22. Bougatef A, Nedjar-Arroume N, Manni L, Ravallec R, Barkia A, Guillochon D, et al. Purification and identification of novel antioxidant peptides from enzymatic hydrolysates of sardinelle (Sardinella aurita) by-products proteins. Food Chem.2010; 118(3): 559-65.
23. Sun J, Yu J, Zhang P-C, Tang F, Yue Y-D, Yang Y-N, et al. Isolation and Identification of Lignans from Caulis Bambusae in Taenia with Antioxidant Properties. J Agric Food Chem. 2013;61(19):4556-62.
24. Li B, Chen F, Wang X, Ji B, Wu Y. Isolation and identification of antioxidative peptides from porcine collagen hydrolysate by consecutive chromatography and electrospray ionization–mass spectrometry.Food Chem. 2007;102(4):1135-43.
25. Mendis E, Rajapakse N, Byun HG, Kim SK. Investigation of jumbo squid (Dosidicus gigas) skin gelatin peptides for their in vitro antioxidant effects. Life Sci. 2005;77(17):2166-78.

Isolation and identification of a new antioxidant peptide from casein camelmilk using pepsin and pancreatin

 

Masoud Homayouni-Tabrizi.,

Department of Biochemistry and Biophysics, Mashhad Branch, Islamic Azad University, Mashhad, Iran

 

Ahmad Asoodeh.,

Department of Chemistry, Faculty of Sciences, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran.

 

Hoda Shabestarian.,

Department of Basic Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran